实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

兔嗅鞘分离自嗅球组织；嗅鞘细胞（OECs）是在功能上介于施旺细胞和少突胶质细胞之间的一种特殊的胶质细胞，具有神经营养、抑制胶质增生、瘢痕形成、成鞘作用等；为轴突生长提供了适宜的微环境及较强的迁移的特性，使其成为促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。嗅鞘细胞是目前所发现的极少数的中枢神经系统可以再生细胞之一，其特点为终身具有神经再生功能，还能够释放多种神经营养因子、神经粘附分子。被认为是髓鞘化能力强的胶质细胞，逐渐用于治疗脊髓损伤。嗅鞘细胞与胶质细胞、雪旺细胞在表现型上有共同点，它们都能促进轴突的再生，主要区别在于嗅鞘细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于外周神经中。嗅鞘细胞被认为是一种可塑性很高的细胞，它可表现出多种细胞形态和细胞表面标志，在嗅系统发育过程中，嗅鞘细胞根据其在组织定位的不同而有不同的抗原表型，其中P75NTR、GFAP、和O4可标记大部分在体嗅鞘细胞，然而在嗅球外神经层O4阳性嗅鞘细胞仍然可以在P75NTR阳性细胞层内分化成E-NCAM阳性的细胞层，还有一定比率的嗅鞘细胞P75NTR阴性而NY和S100表型为阳性。嗅黏膜中的神经元是生后才生长并在成年时继续分化的神经元，寿命为4-12周，随着新细胞的生长，又建立了新的神经支配关系。嗅鞘细胞存在于嗅神经及嗅球的神经层上，沿嗅神经的全长，从周围神经系统到中枢神经分布。

方法简介：

实验室分离的兔嗅鞘采用-胶原酶联合消化法、结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的兔嗅鞘经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

包被条件：PLL（0.1mg/ml）

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态：神经元、上皮细胞样

传代特性：可传1代，不建议传代

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

兔嗅鞘体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和尊龙凯时联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和尊龙凯时联系，告知细胞的具体情况，以便尊龙凯时的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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