实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠子宫成纤维分离自子宫组织；子宫是孕育胎儿的器官，位于盆腔中部，膀胱与直肠之间，其位置可随膀胱与直肠的充盈程度或体位而有变化。子宫的正常位置主要依靠子宫诸韧带、盆膈、尿生殖膈及会阴中心腱等结构维持，这些结构受损或松弛时，可以引起子宫脱垂。成纤维细胞（Fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来；成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化；成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用。刚分离的子宫成纤维细胞呈圆形、折光性良好，悬浮于培养基中。30min细胞贴壁，其中部分开始伸出伪足，表现为小的突起；6h后细胞基本贴壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布较均匀，散在生长，不聚集成团；细胞生长迅速，5-7天即呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，平坦、胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，颜色淡。细胞融合，并彼此连接成网状；细胞呈突起的纺锤形或星形的扁平分布。子宫成纤维细胞的主要特征：①是子宫的重要细胞组成，在体外易于培养；②在子宫损伤后能修复和重塑子宫；③在子宫炎症时能有效控制炎症扩散。

方法简介：

公司实验室分离的大鼠子宫成纤维采用-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶。

质量检测

公司实验室分离的大鼠子宫成纤维经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 成纤维细胞样

传代特性 可传5代左右；3代以内状态佳

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和尊龙凯时联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和尊龙凯时联系，告知细胞的具体情况，以便尊龙凯时的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品：

小鼠胶原酶Ⅲ(CollagenaseⅢ)试剂盒   96T/48T

小鼠降钙素原(PCT)试剂盒   96T/48T

小鼠降钙素受体(C)试剂盒   96T/48T

小鼠降钙素基因相关肽(CGRP)试剂盒   96T/48T

小鼠0酸化细胞外信号调节激酶(pERK)ELISA 试剂盒 96T/48T

Rat connective tissue growth factor (CTGF) ELISA Kit 大鼠结缔组织生长因子(CTGF)试剂盒

Humanα-sarcomericactin,α-SCAELISAKit 人α横纹肌肌动蛋白(α-SCA)试剂盒 96T/48T 进口分装

HumanAdenovirusAigen,ADV-Ag试剂盒人腺病毒抗原(ADV-Ag)试剂盒规格：96T/48T

直接细胞克隆两步法逆转录PCR试剂盒100次

Mousealpha-fetoproteinLensculinarisaggliin3,AFP-L3ELISAKit小鼠小扁结合型甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)试剂盒规格：96T/48T

SERPINA6重组小鼠 SerpinA6 / CBG 蛋白 Protein

ACE( ACE, testis-specific isoform precursor 0.5mgACE( ACE, testis-specific isoform precursor) 血管紧张素转换酶(抗原)

FKBP7重组人 PPIase / FKBP7 蛋白 (Fc 标签) Protein

DAPK1 Protein Human 重组人 DAPK1 / DAP Kinase 1 蛋白 (aa 1-363, His & GST 标签)

LAMP1 Protein Rat 重组大鼠 LAMP1 / CD107a 蛋白 (Fc 标签)

ACE( ACE, testis-specific isoform precursor 0.5mgACE( ACE, testis-specific isoform precursor) 血管紧张素转换酶(抗原)

DAPK1 Protein Human 重组人 DAPK1 / DAP Kinase 1 蛋白 (aa 1-363, His & GST 标签)

SERPINA6重组小鼠 SerpinA6 / CBG 蛋白 Protein

LAMP1 Protein Rat 重组大鼠 LAMP1 / CD107a 蛋白 (Fc 标签)

FKBP7重组人 PPIase / FKBP7 蛋白 (Fc 标签) Protein

大鼠子宫成纤维细胞大鼠载脂蛋白C1(APOC1)试剂盒 ，英文名： APOC1 ELISA Kit

Mouse phosphotylinosital 3 kinase (PI3K) ELISA Kit 小鼠0酸肌醇3激酶(PI3K)试剂盒

MouseLeptin,LEPELISAkit 小鼠瘦素(LEP)试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforHumanfibromodulin,FMODELISAKit人纤调蛋白

细胞/组织高质化高尔基体分离试剂盒10次

ELISAKitMMP-5大鼠基质金属蛋白酶5