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如何使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验
点击次数：750 更新时间：2024-08-19
使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验是一个复杂但精确的过程，涉及多个关键步骤。以下是一个详细的实验流程，旨在指导如何正确使用该试剂盒进行RNA的检测和定量分析。
一、实验前准备
1.了解试剂盒信息：首先，仔细阅读试剂盒的说明书，了解试剂盒的组成、储存条件、有效期以及实验所需的设备和试剂。
2.实验设备和试剂准备：
-荧光定量PCR仪：确保仪器已经过校准，并熟悉其操作界面。
-微量移液器、离心机、涡旋振荡器、分光光度计等实验设备。
-无RNA酶的离心管、枪头、EP管等耗材。
-试剂包括RNA提取试剂（如RNAiso Plus）、氯仿、异丙醇、75%乙醇（DEPC水配制）、反转录试剂、qPCR反应液等。
二、实验步骤
1.细胞总RNA提取
1.细胞裂解：对于贴壁细胞，弃去培养液后，用PBS清洗一次，加入适量RNA提取试剂（如RNAiso Plus），吹打均匀后室温静置5分钟。
2.两相分离：加入适量的氯仿（如每1ml RNAiso Plus加入200μl氯仿），剧烈振荡后室温静置5分钟，然后4℃离心15分钟（12000G）。此时，混合物将分为三层，RNA主要在水相上层。
3.RNA沉淀：小心吸取上层水相转移至新的无RNA酶离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10分钟，再4℃离心10分钟（12000G）。此时，RNA将在管底部形成胶状沉淀。
4.RNA清洗：弃去上清，加入适量的75%乙醇（用DEPC水配制），轻轻上下颠倒混匀，4℃离心5分钟（7000rpm），重复清洗1-2次。
5.RNA干燥与溶解：小心吸去乙醇，室温干燥RNA沉淀5-10分钟，避免过分干燥。然后加入适量的无RNA酶水溶解RNA，保存于-80℃备用。
2.RNA浓度和纯度测定
使用分光光度计测定RNA溶液在260nm和280nm处的吸光度值，计算RNA的浓度和纯度（A260/A280比值应接近2.0）。
3.反转录合成cDNA
根据反转录试剂盒的说明书，将RNA反转录成cDNA。这通常涉及在RNA溶液中加入反转录酶、引物和其他必要组分，然后在适当的温度下孵育一段时间。
4.qPCR实验
1.配置qPCR反应液：按照试剂盒说明书，将qPCR反应液的各组分按比例混合，并加入适量的cDNA模板。
2.点板：将配置好的qPCR反应液加入96孔板或八联管中，注意避免气泡和液滴贴壁。
3.上机检测：将加好样的孔板或八联管放入荧光定量PCR仪中，设置合适的反应条件（如温度循环和荧光信号采集模式），开始实验。
4.数据分析：实验结束后，收集并分析荧光信号数据，根据标准曲线或CT值计算目标基因的相对表达量。
三、注意事项
1.避免污染：整个实验过程中应严格遵循无RNA酶操作原则，防止RNA降解和污染。
2.精确操作：在加样、离心等步骤中，应精确控制体积和时间，确保实验结果的可重复性。
3.设备校准：定期对荧光定量PCR仪等实验设备进行校准和维护，确保仪器的准确性和稳定性。
4.储存条件：试剂盒和试剂应储存在推荐的温度下（通常为2-8℃或-20℃），避免光照和反复冻融。
使用荧光定量RT-PCR试剂盒进行实验需要严格遵循实验步骤和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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