1．免疫染色可在涂片或组织切片上进行免疫染色。首先，标记抗体与标本中抗原反应结合。其次，用PBS吸取未结合成分。zui后，直接观察结果(免疫荧光直接法)或显色后再用显微镜观察(免疫酶直接法)。在此基础上发展出间接法、多层法，双标记法等各种方法。在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都应注意以下几个问题：

(1)增强特异性染色方法

1)蛋白酶消化法：目的是暴露抗原，增加细胞和组织通透性，使抗原抗体zui大限度结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。该法已广泛用于各种免疫细胞化学染色。常用蛋白酶有、及等；酶消化时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同，应根据酶活性通过预实验确定，消化时间还与组织固定的时间有关，越陈旧固定组织所需时间越长，以37℃为宜。

2)适宜的抗体稀释度：抗体浓度是免疫染色关键步骤。浓度过高，抗体分子多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。

3)温育时间：一般抗体温育时间为30～60min，必要时可4℃过夜。温育温度常用37℃，也可在室温中进行。37℃可增强抗原抗体反应，适用于多数抗原染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。

4)多层染色法：对弱抗原可用直接法(双层)、辣根过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)和抗一(ABC)法(j层)，四层或五层PAP法或ABC法，或PAP和ABC联合染色法等，可很大程度提高敏感性，获得良好结果。

5)其他增敏方法：如微波处理法、酪氨酰胺信号放大技术(tyramide signal smplmcation，TSA)增敏方法以及免疫PcR方法等。

(2)减少或消除非特异性染色的方法：组织中，非抗原抗体出现的阳性染色称为非特异性背景染色，zui常见原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。有效消除方法是在用*抗体前，加与制备*抗体相同的动物的非免疫血清(1：20～l：5)，封闭组织上带电基团而除去与*抗体非特异性结合。必要时加入2％～5％牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色，作用时间为lO～20min。

(3)显色反应的控制：免疫酶染色应注意：1)成色质浓度和反应时间。增加成色质的量和(或)增加底物反应时间，可增加反应产物强度，着色太深可减少反应时间。2)过氧化物酶显色时，H2O2浓度较大将使显色反应过快而导致背景加深，过量H2O2可抑制酶活性。

(4)复染：根据所用实验方法和呈现颜色不同，可选用适当复染方法。如阳性结果呈红色或棕色，则用苏木素将核染成蓝色，以便定位检测。

4．对照设对照目的在于tiEBIj阳性结果的特异性，排除非特异性结果。主要针对*抗体对照，常用对照方法包括：阳性对照、阴性对照、阻断试验、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验。

5．免疫细胞化学结果判断对免疫细胞化学结果判断应注意几点：①准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照试验，对新发现阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复试验，并用几种方法进行验证。②判定特异性染色和非特异性染色：特异性反应产物常分布于特定部位，且在同一切片上呈现不同程度阳性染色结果。而非特异性染色表现为无一定的分布规律，常呈某一部位成片的均匀着色，和周围结缔组织均无区别着色，或结缔组织呈现很强的染色；常出现于干燥切片边缘，有由于过强刀痕或自制折叠的部位；在过大组织块，中心固定不好也会造成非特异染色。当非特异性染色和特异性染色同时存在时，过强的非特异性染色背景会影响对特异性染色结果的观察和记录。

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