细胞处理:
1、复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2、细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1)弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2)加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3)按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4)将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
接下来,细胞在新的培养环境中继续生长,需要密切关注其状态。每天定时观察细胞形态、密度以及培养基的颜色变化,确保无细菌或霉菌污染。若培养基因细胞代谢而变黄,应及时更换新鲜培养基,以维持良好的生长环境。
在细胞培养过程中,温度、湿度及CO₂浓度的控制至关重要。通常,哺乳动物细胞培养在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行,这样的条件能够模拟体内环境,促进细胞增殖。定期检查培养箱的性能参数,确保它们处于最佳状态,是细胞培养成功的关键。
此外,细胞的健康状态还需通过细胞活力检测来评估。常用的方法包括台盼蓝染色法,通过染色区分活细胞与死细胞,从而计算出细胞活力百分比。保持高细胞活力对于后续实验,如细胞转染、细胞分化研究或药物筛选等,都是至关重要的。
当细胞生长至适宜密度时,根据实验需求,可进行冻存保藏或进一步实验处理。细胞冻存时,需先配置含有适当比例血清和DMSO的冻存液,将细胞悬液与冻存液混合后,置于程序降温盒中,逐步降温至-80℃超低温冰箱,最终转移至液氮罐中长期保存。这一过程确保了细胞的长期存活和实验的可重复性。
综上所述,细胞处理是一个精细且需要耐心的工作,从复苏到传代再到后续的维护,每一步都需严格遵循操作规程,以确保细胞的健康生长和实验的成功进行。